De genomyske sekwinsjes fan de measte firussen binne bekend.Nucleic acid probes dy't koarte segminten fan DNA binne ûntworpen om te hybridisearjen mei komplemintêre virale DNA of RNA segminten.De polymerase kettingreaksje (PCR) is in effisjinter technyk foar virale deteksje.Diagnostyske metoaden mei hege trochset binne koartlyn ûntwikkele.
A. Nucleic acid hybridization technyk
Nucleic acid hybridization, benammen ynklusyf Southern blotting (Súdlik) en Northern blotting (Noardlik), is in rap ûntwikkeljen nije technyk yn it firus diagnostyske fjild.De reden fan 'e hybridisaasje-assay is om koarte segminten fan DNA te brûken (neamd "probe") ûntworpen om te hybridisearjen mei komplementêre virale DNA- as RNA-segminten.Troch ferwaarming of alkaline behanneling, dûbele strâne doel DNA of RNA wurde skieden yn inkele stringen en dan wurde ymmobilisearre op in fêste stipe.Dêrnei wurdt probe tafoege en hybridisearre mei it doel DNA as RNA.As de sonde is markearre mei isotoop of net-radioaktive nuclide, kin it doel DNA of RNA wurde ûntdutsen troch autoradiografy of troch it biotine-avidinsysteem.Om't de measte virale genomen binne klonearre en sequenteare, kinne se wurde ûntdutsen mei firusspesifike sekwinsjes as probes yn it eksimplaar.Op it stuit omfetsje de hybridisaasjemetoaden: dot blot, in situ hybridisaasje yn sellen, DNA blotting (DNA) (Southern blot) en RNA blotting (RNA) (Northern blot).
B.PCR Technology
Yn 'e ôfrûne jierren is in searje fan in vitro nukleïnesoeramplifikaasjetechniken ûntwikkele op basis fan PCR, om ûngefoelige as net te kultivearjende firussen te testen.PCR is in metoade dy't spesifike DNA-sekwinsje kin synteze troch in vitro polymerase-reaksje.It proses fan PCR omfettet in thermyske syklus fan trije stappen: denaturaasje, annealing, en útwreiding By hege temperatuer (93 ℃ ~ 95 ℃) wurdt de dûbelstrengige DNA skieden yn twa inkele DNA-strengen;dan by lege temperatuer (37 ℃ ~ 60 ℃), twa synthesized nucleotide primers anneal oan de komplementêre DNA segminten;wylst by de passende temperatuer foar Taq-enzyme (72 ℃), synteze fan nije DNA-keatlingen begjint fan primer 3'end mei komplemintêr DNA as sjabloanen en inkele nukleotiden as materialen.Dus nei elke syklus kin ien DNA-ketting wurde fersterke yn twa keatlingen.Werhelje dit proses, elke DNA keten synthesized yn ien syklus kin brûkt wurde as sjabloan yn de folgjende syklus, en it oantal DNA keatlingen wurdt ferdûbele yn elke syklus, dat betsjut dat de produksje fan PCR wurdt fersterke yn in 2n log snelheid.Nei 25 oant 30 syklusen wurdt de produksje fan PCR identifisearre troch elektroforese, en de spesifike DNA-produkten kinne wurde waarnommen ûnder UV-ljocht (254nm).Foar syn foardiel fan spesifisiteit, gefoelichheid en gemak is PCR oannaam yn klinyske diagnoaze fan in protte virale ynfeksjes lykas HCV, HIV, CMV, en HPV.Om't PCR heul gefoelich is, kin it firus-DNA op fg-nivo detektearje, moat de operaasje heul foarsichtich wurde útfierd om falsk posityf te foarkommen.Derneist betsjuttet posityf resultaat yn 'e nukleïnsûrtest net dat d'r live ynfekteare firus yn' e stekproef is.
Mei brede tapassing fan PCR-technyk wurde nije techniken en metoaden ûntwikkele basearre op PCR-technyk foar ferskate testdoelen.Bygelyks, de echte tiid kwantitative PCR kin detect virale lading;in situ PCR wurdt brûkt om firus ynfeksje te identifisearjen yn weefsel as sellen;De geneste PCR kin de spesifisiteit fan PCR ferheegje.Under harren is real-time kwantitative PCR rapper ûntwikkele.In protte nije techniken, lykas TaqMan hydrolyseprobe, hybridisaasjeprobe, en molekulêre beaconprobe, binne kombineare yn realtime kwantitative PCR-technyk, dy't in soad brûkt wurdt yn klinysk ûndersyk.Njonken it krekt identifisearjen fan de virale lading yn 'e lichemsfloeistof fan pasjinten, kin dizze metoade ek brûkt wurde om drugstolerante mutant te detectearjen.Dêrom wurdt real-time kwantitative PCR benammen tapast yn evaluaasje fan kurative effekt en tafersjoch op drugstolerânsje.
C. High-throughput-deteksje fan virale nukleïnesoeren
Om te foldwaan oan 'e behoeften foar rappe diagnoaze fan nije opkommende ynfeksjesykten, binne ferskate metoaden foar deteksje mei hege trochset, lykas DNA-chips (DNA), fêststeld.Foar DNA-chips wurde spesifike probes syntetisearre en hechte oan lytse silisiumchips yn heul hege tichtheid om DNA-probe-mikroarray (DNA) te foarmjen dy't kinne wurde hybridisearre mei monster.It sinjaal fan hybridisaasje kin ôfbylde wurde troch konfokale mikroskoop as laserscanner en fierder ferwurke wurde troch de kompjûter en enoarme gegevensset oangeande ferskate genen kinne wurde krigen.D'r binne twa soarten DNA-chips.De "synteze-chip" is as folgjend: de spesifike oligonukleotiden wurde direkt op 'e chips synthesisearre.In oare is DNA pool chip.De klonearre genen as PCR-produkten wurde oarderlik printe op 'e slide.It foardiel fan DNA-chiptechnology is de simultane deteksje fan in enoarme hoemannichte DNA-sekwinsjes.De lêste ferzje fan patogendeteksjechip kin mear dan 1700 minsklike firussen tagelyk identifisearje.DNA-chiptechnology lost de problemen op fan tradisjonele nukleïnesûrhybridisaasjemetoaden en hat heul brede tapassingen yn virale diagnoaze en epidemyologyske stúdzje.
Posttiid: Dec-23-2020